题目：新的方法—LNP-mRNA的转染效率可大幅提升！

前言

在提升LNP-mRNA转染效力的问题上，多数研究者会采用两种方式：1.更换已公开的配方进行尝试；2.开发新的可电离脂质。从逻辑上讲，两种方式都没有问题，但如果对配方过程的优化更深一步，相信新的发现会指引我们更好的解决问题。下文将主要介绍LNP-mRNA合成时酸性缓冲液的变化带来的一系列影响。

缓冲液类型和浓度的变化诱导泡状结构形成

研究人员采用KC2脂质配方，具体组成为KC2/DSPC/胆固醇/PEG-DMG (50/10/38.5/1.5 mol%)，引入Dil或Dio（荧光染料，适用于FRET分析）。在包裹mRNA时使用多种pH4缓冲液，分别为：25 mM NaOAc、300 mM NaOAc、300mM CitPhos及300mM Na-citrate，包裹完成后在pH 7.4的PBS中透析。

表1.使用不同pH 4缓冲液配制的LNP-mRNA体系平均‍‍‍粒径、PDI‍‍‍和包封效率

对比表1中数据可知，酸性缓冲液的类型、浓度对所制备粒子的粒径、PDI及包封率均有影响。总体上看，粒子的直径与缓冲液浓度呈正相关关系，包封率则恰好相反。

图1.高浓度pH 4缓冲液中合成的LNP-mRNA可诱导泡状结构的形成并提高体外转染效率

当酸性缓冲液为25 mM的NaOAc时，仅观察到LNP-mRNA“实核”结构，未有明显泡状结构形成（如图1d）；而在300 mM NaOAc、CitPhos及Na-citrate的缓冲条件下，体系分别显示出LNP总面积5%、44%和59%的泡状结构（图1c、e、f、g）。

用不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA孵育Huh7细胞，24小时检测其发光强度。如图1b所示，在300 mM条件下制备的LNP-mRNA，其发光强度远高于在25 mM条件下制备的。由此推测，泡状结构的形成有利于增强mRNA的转染效果，但转染效果的增强不能归因于摄取的增加（图2，摄取量未增加）。

图2.不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA体外吸收对比

可电离脂质的种类影响泡状结构的形成

图3. 使用不同类型可电离脂质的表征结果

研究人员选用了多种离子型脂质，通过低温透射电镜观察不同缓冲浓度下LNP-mRNA的形貌差异。选用的离子型脂质有MC3、ALC-0315和SM-102，缓冲液对比浓度为25 mM和300mM。

表2为LNP-mRNA的物理参数，在300 mM的缓冲条件下，MC3和ALC-0315组粒子的尺寸显著增加，且包封率有下降；而SM-102组的粒子尺寸和包封率都维持的非常好。

观察图3a中的细胞孵育结果，相比于25 mM缓冲液，在300mM条件下，三种脂质所对应的体系荧光强度分别增加了20倍、4倍和2倍（0.3 μg mRNA/mL）。统计电镜数据可得（图3d-i），泡状结构占比也从2%、4%和53%提升为76%、21%及更大结构的气泡。由此可见，缓冲液浓度的提升真实的提高了LNP-mRNA的转染效力，即使包封率有所下降，而可电离脂质的不同也会对泡状结构的水平产生影响。

表2. 不同缓冲浓度下形成的LNP-mRNA粒径、PDI及包封率参数

具有泡状结构的LNP-mRNA可提升小鼠体内转染水平

图4.LNP-mRNA小鼠体内表达图

接下来，研究人员针对KC2和SM-102所在的配方进行体内研究。以0.5 mg/kg的mRNA剂量静脉注射给CD-1小鼠，在注射后3、6、24小时检测生物发光。

如图4所示，与25 mM NaOAc缓冲液相比，使用300 mM Na-citrate缓冲液制备的两种LNP-mRNA在肝脏和脾脏中的基因表达均显著提高，KC2相较于SM-102表现出了更优越的转染效力，且两者在注射后24小时仍可观察到荧光蛋白的表达。

最后，研究人员进行了毒性测试。结果表明，在较高缓冲浓度下制备的LNP-mRNA没有引发更强的毒性。注射后24小时，两种（不同缓冲液浓度下制备）LNP-mRNA制剂的血液学、生物化学及细胞因子参数水平无显著差异（图5）。

图5.LNP-mRNA有无泡状结构系统毒性无显著差异

泡状结构可增强被封装mRNA的完整性

图6.不同缓冲条件下mRNA完整性及翻译能力对比

泡状结构的出现为何能显著提升LNP-mRNA的转染性能，针对此问题，研究人员进行了大量的论述，认为泡状结构的出现增强了被封装mRNA的完整性。此结论或许还需要更多的研究来进行证明，但图6、图7的数据也从某种程度上说明了这种结论的可靠性。300mM的缓冲条件下，mRNA具有更强的翻译能力，且制成的LNP-mRNA在50% FBS中孵育一段时间后，显示出更好的mRNA完整性。总而言之，这些数据或推论，对于此领域的研究有着重要的指导推进作用。

图7.mRNA完整性检测

结论

通过对配方过程的深入优化，作者给予我们了一个重要结论，即酸性缓冲液的类型/浓度变化会大大影响LNP-mRNA的形貌及性能，这也为提升mRNA转染效力打开了一扇全新的大门，让研究者在关注可电离脂质开发之余，也关注mRNA的完整性及封装相关的重要参数，诸多考量，多向发力，定能加速此领域开发前进的步伐。

参考文献：

1. Cheng MHY, Leung J, Zhang Y, Strong C, Basha G, Momeni A, Chen Y, Jan E, Abdolahzadeh A, Wang X, Kulkarni JA, Witzigmann D, Cullis PR. Induction of Bleb Structures in Lipid Nanoparticle Formulations of mRNA Leads to Improved Transfection Potency. Adv Mater. 2023 May 12:e2303370. doi: 10.1002/adma.202303370. Epub ahead of print. PMID: 37172950.